El semen equino se deteriora rápidamente cuando es conservado a temperatura ambiente, viéndose afectada principalmente la motilidad a las pocas horas de su colecta. Pero su fertilidad se puede mantener a largo plazo si se toma el recaudo de extenderlo lo más pronto posible en diluyentes apropiados (Braun et al., 1994a; Samper, 2000). Aparentemente un componente normal del plasma seminal afecta en forma rápida la motilidad espermática (Pickett et al., 1975), por esta razón se ha recomendado que si no va a ser utilizado inmediatamente (<30’), debe extendérselo a una proporción de 1:3 al 1:10 (semen:diluyente), dependiendo de su concentración celular. A pesar de lo señalado, un mínimo de plasma seminal sería conveniente para mantener una buena motilidad espermática (Braun et al., 1994b; Brinsko et al., 2000).
Un diluyente exitoso y largamente probado para conservar semen equino refrigerado (5°C) es el confeccionado en base a leche descremada y glucosa (Kenney et al., 1975), que resulta práctico y económico para proteger a los espermatozoides equinos arriba de las 96 h; uno de los principales problemas para una adecuada conservación in vitro lo constituye el daño oxidativo o peroxidación de los lípidos de membrana, que compromete la motilidad y la fertilidad durante la conservación, especialmente cuando el semen no es diluido. Los espermatozoides anormales o dañados durante el enfriamiento, serían los que generan una gran cantidad de sustancias oxidantes (Ball et al., 2001) conocidas como ROS (reactive oxygen species), por lo que actualmente se investigan sustancias antioxidantes que prevengan el daño durante el enfriamiento. En este sentido, algunas metilxantinas, como la cafeína, o algunas sales, como el lactato de sodio, pueden resultar de utilidad práctica para mejorar la preservación del semen equino refrigerado o criopreservado.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del lactato de sodio y de la cafeína sobre la motilidad de los espermatozoides equinos, agregándolos al momento de la dilución o luego de 48 h de conservación en heladera (5°C).
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizaron tres experiencias diferentes para las cuales se utilizó semen proveniente de tres padrillos de la raza Peruano de Paso, obtenido con vagina artificial (mod. Colorado), descartándose la fracción gelatinosa. El diluyente base (DB) utilizado se preparó con 24 g de leche descremada comercial de alta calidad (Molico, Nestlé Argentina) y 49 g de glucosa anhidra (Cicarelli) diluidos cada componente por aparte en 500 ml de agua tibia bid***ada en vidrio y esterilizada en autoclave. Una vez que cada componente estuvo totalmente disuelto fueron mezclados cuidadosamente. Finalmente se le añadió amicacina (10.000 µg/100 ml de diluyente) como antibiótico.
En la primera experiencia, luego de recolectado el semen se separaron tres fracciones iguales; la primera fracción se diluyó 1:3 con DB (T1); la segunda a igual dilución con el mismo diluyente conteniendo 2 mM de lactato de sodio (T2), mientras que la tercera fue con diluyente conteniendo 10 mM de cafeína anhidra (T3). La concentración espermática se ajustó a 50 x 106 espermatozoides por mI aproximadamente.
Las distintas formulaciones fueron enfriadas en un baño María provisto de circulación forzada de agua. El enfriamiento se programó para que la temperatura descendiera lentamente a razón de 1°C cada 10 minutos, desde 27°C hasta 5°C, para lo cual se agregó al agua refrigerantes congelados. Una vez alcanzada la temperatura de 5°C, las muestras se llevaron a heladera donde fueron mantenidas durantes 96 h.
Para obtener los datos de motilidad se colocó una gota de 20 µl de cada muestra sobre un portaobjeto limpio, ubicado sobre una platina térmica a 37°C, y tapada cuidadosamente con un cubreobjetos de 20 x 20 mm precalentado. Se realizaron observaciones cada 24 h durante 4 días, registrándose subjetivamente el porcentaje de espermatozoides móviles (en múltiplos de 10). También se realizaron video-filmaciones a fin de analizar posteriormente con detenimiento los distintos parámetros para una lectura cooperativa más objetiva.
En una segunda experiencia, se mantuvo semen diluido con DB por 48 h a 5°C, enfriado bajo las mismas condiciones que en el estudio anterior; a los dos días de almacenamiento, se tomaron tres fracciones de 10 ml por muestra, a las que se les agregaron respectivamente 10 ml de DB; 10 ml de diluyente conteniendo 4 mM de lactato (T4) y 10 ml de DB conteniendo 20 mM de cafeína (T5). Las muestras fueron monitoreadas durante 48 h adicionales (96 h desde extracción).
Con estas mismas muestras almacenadas a 5°C y luego de agregar los diluyentes, se programó una tercera experiencia para estudiar la supervivencia espermática a 37°C. Alícuotas de 2 ml fueron colocadas en tubo de hemólisis y cultivadas en baño María a 37°C, para observar porcentaje de espermatozoides móviles a los 30 minutos, a la hora y a las 2 h.
Finalmente, se comparó el efecto del lactato y de la cafeína sobre los espermatozoides, incorporados al momento de la dilución o luego de 48 h a 5°C.
Los resultados fueron analizados mediante ANOVA y prueba de rangos múltiples de Duncan, utilizando el paquete estadístico SPSS.
RESULTADOS
Adición de lactato y cafeína al momento de la dilución.
Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 1. Existe una marcada diferencia, estadísticamente significativa, entre las formulaciones conteniendo lactato y cafeína respecto a la muestra extendida con DB solo, induciendo éstas movimientos espermáticos más vigorosos desde el inicio de la dilución. Este levantamiento de la motilidad se prolonga significativamente en el tiempo.
Figura 1. porcentaje de espermatozoides móviles en semen equino almacenado a 5ºC lactato y cafeína incorporados al momento de la dulición.
Adición de lactato y cafeína a las 48 h y posterior conservación a SoCo
El semen diluido en DB (T1) presentó, al inicio del almacenamiento a 5°C, entre un 60 y un 70% de espermatozoides móviles para los tres padrillos en estudio. A las 48 h el porcentaje de espermatozoides móviles había decaído aproximadamente al 30% con pérdida manifiesta del vigor. La adición, tanto de lactato (T4) como de cafeína (T5). produjo en este punto una notable recuperación del número de espermatozoides en movimiento. con una elevada proporción de espermatozoides moviéndose vigorosamente. En la Figura 2 se pueden observar las curvas desde el momento de la dilución. Existen diferencias significativas a favor de las muestras con cafeína.
Figura 2. Porcentaje de espermatozoides móviles en semen equino almacenado a 5ºC lactato y cafeína incorporados luego de 48 h en heladera.
Adición de lactato y cafeína a las 48 h y posterior cultivo a 37°C.
Los resultados se presentan en la Figura 3. Cuando a las 48 h se incubaron alícuotas de 2 ml de semen a 37°C, con o sin lactato o cafeína adicionados, los espermatozoides acondicionados en DB presentaban, a los 30 minutos de incubación, un pobre porcentaje de espermatozoides móviles (5%), para decaer aún más durante los 30 minutos siguientes. Se registraron diferencias significativas con el testigo, en tanto que entre los aditivos estudiados fue superior significativamente la cafeína (P<0,01).
Figura 3. Porcentaje de espermatozoides móviles en semen equino cultivado a 37ºC previo almacenaje de 48 h a 5ºC con lactato y cafeína incorporados luego de este período.
Comparando los tratamientos en base al momento de la incorporación de los aditivos (T2 vs. T4 y T3 vs. T5), se obtuvieron los resultados observados en los Cuadros 1 y 2. No se registraron diferencias estadísticamente significativas, salvo en el caso del diluyente con cafeína a las 72 y 96 h de almacenaje, en el primer caso a favor del T3 y en el segundo del T5.
Cuadro 1.Motilidad en las muestras adicionadas con Lactato.
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Tratamiento 48 72 96
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T2 45ns 25ns 10ns
T2 49ns 21ns 10ns
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‡T2: DB con Lactato, incoporado al momento de la dilución. T4: DB con Lactato, incoporado a las 48 h de almacenaje a 5ºC.
ns: Diferencias no significativas entre tratamientos en un mismo tiempo.
Cuadro 2. Motilidad en las muestras adicionadas con Cafeína.
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Tratamiento Tiempo (h)
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48 72 96
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T3 47ns 35* 10*
T5 49ns 25* 15*
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‡T3: DB con Cafeína, incoporado al momento de la dilución. T5: DB con Lactato, incoporado a las 48 h de almacenaje a 5ºC.
† Diferencias estadísticas entre tratamientos (P<0,01).
ns: Diferencias no significativas entre tratamientos.
DISCUSIÓN
La actividad cinética de los espermatozoides produce residuos metabólicos oxidantes, los cuales resultan tóxicos para estas células, fenómeno conocido como estrés oxidativo, el cual deprime la supervivencia y fertilidad espermática. A su vez, el enfriamiento a 5°C induce una transición en la membrana espermática desde un estado líquido cristalino a gel, alterando su fluidez y por lo tanto su estructura molecular (Buhr et al., 1989), lo que contribuye al daño oxidativo. Éste es uno de los factores más importantes que comprometen la motilidad y fertilidad espermática durante la conservación y especialmente durante el enfriamiento. Se ha intentado minimizarlo reduciendo la tensión de oxígeno por adición de antioxidantes al medio de dilución, varios agentes fueron ensayados (Ball et al., 2001).
Existen evidencias que sugieren claramente que las especies oxígeno reactivas (ROS) juegan un rol importante en la fertilidad, sobre todo en los procesos de congelamiento-descongelamiento dañando la función espermática (Bilodeau et al., 2000). Aparentemente, los espermatozoides equinos generan ROS in vitro, posiblemente vía reacción oxidativa de NADPH, siendo los espermatozoides dañados durante el enfriamiento y aquellos morfológicamente anormales los que generan cantidades más altas de ROS que los normales (Ball et al., 2001).
La rápida pérdida de la motilidad flagelar inducida por ROS ha sido asociada a la caída en los niveles endógenos de ATP, seguido de daño axonemal por insuficiente fosforilación (de Lamirande y Gagnon, 1992); hay evidencias que demuestran que el A TP actúa directamente sobre la motilidad y no sobre el metabolismo espermático (Harrison, 1975). Para mantener la motilidad espermática por periodos prolongados hay que minimizar el estrés oxidativo, reduciendo la tensión de oxígeno y agregando agentes antioxidantes.
La cafeína adicionada en el reconstituyente de semen congelado bovino (pellets), no resultó efectiva (Wilde et al., 1989; 1990). En tanto que su utilización en los diluyentes previo a la criopreservación dio resultados positivos con el agregado de 10 mM, no así con 6 mM (Wilde et al., 1996; de la Vega et al., 1997).
En esta experiencia, la adición en forma separada de cafeína y de lactato al diluyente produjo un rápido y notable incremento, tanto en la impulsión flagelar como en la proporción de espermatozoides móviles. La respuesta de los espermatozoides diluidos en DB conteniendo cafeína o lactato es inmediata y concuerda con trabajos previos realizados con semen de otras especies. La motilidad, expresada en porcentaje de espermatozoides móviles, decayó en los tres tratamientos a lo largo del periodo de conservación a 5°C, pero manteniendo una diferencia favorable en los almacenados con aditivos (T1 y T3), la cafeína (T3) fue superior allactato (T1) únicamente a las 72 h.
Es interesante comprobar como el agregado de lactato y cafeína a un semen que se está aparentemente agotando luego de una conservación a 5°C por 48 h (T4 y T5), permite una recuperación de la motilidad de manera casi instantánea; en el transcurso del tiempo resulta más efectiva la cafeína (T5). Ésta conservaba, a las 72 h, un 25% de formas móviles con una buena proporción de espermatozoides avanzando vigorosamente, mientras que el tratamiento con lactato (T4) presentaba un 21% de motilidad con movimiento oscilatorio y escaso movimiento progresivo. El tratamiento testigo (T1) no tenía formas móviles o contenía muy pocas con movimientos oscilatorios.
En el cultivo a 37°C ambos aditivos (T4 y T5) superaron los registros obtenidos con DB (T1). Los espermatozoides incubados con lactato presentaron un moderado porcentaje de espermatozoides móviles desde los 30 minutos hasta la hora de incubación (29%), en tanto que a las 2 horas los espermatozoides con éstas características constituyeron solamente el 10% de la población. El semen incubado con cafeína presentó una elevada proporción de espermatozoides móviles inicial (51%) con vigorosos movimientos, para decaer a los 60 minutos a un 29 % de motilidad, valor que se mantuvo durante la hora siguiente.
Respecto al momento de incorporación de los aditivos, el lactato de sodio no presentó diferencias, por lo que resulta indistinta su utilización a la dilución (T2) o a las 48 h (T4). La adición de cafeína al inicio (T3) resultó superior luego de 72 h de almacenaje (35% vs. 25%), en tanto que a las 96 h se observó la relación inversa (10% vs. 15%); esto posiblemente debido a que el incremento de la actividad por efecto del aditivo durante un lapso más prolongado (T3), derivó en un mayor agotamiento espermático en el largo plazo (96h).
CONCLUSIONES
Se concluye que el lactato y la cafeína pueden ser utilizados en diluyentes de semen equino base leche descremada-glucosa como estimulante de la motilidad y supervivencia espermática. Su incorporación resulta interesante en IA, tanto al momento de la dilución del semen, como luego de 48 h de conservación. La cafeína mostró mejores resultados en las tres experiencias programadas, pero el lactato de sodio también es una opción válida por su clara supremacía sobre el testigo.
El momento de inclusión de los aditivos es indistinto, en el caso de la cafeína la superioridad varía de un tratamiento a otro según el tiempo, por lo que no se puede aconsejar una modalidad en particular; ambas son válidas.
SALUDOS
